細胞生物學實驗報告
掃描電子顯微鏡生物樣品制備與觀察
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【實驗目的】
1、了解掃描電鏡的基本結構與工作原理
2、了解掃描電鏡的基本使用方法
3、了解臨界點干燥儀的工作原理了解掃描電鏡生物樣品制備的基本過程
【實驗原理】
掃描電鏡主要用于觀察樣品表面幾何形貌。一般掃描電鏡生物樣品制備過程包括取材、固定、脫水、干燥以及導電處理等步驟。取材時應盡量保護待觀察的樣品表面(如細胞表面、組織或器官的上皮表面等)，并且避免樣品表面在清洗過程中的人為損傷。一般生物樣品需經干燥后才能在掃描電鏡下觀察。由于表面張力的作用，含水量大的生物樣品在自然干燥過程中，其表面形貌將發生嚴重變形。
為了觀察生物樣品真實的表面形貌，通常采用臨界點干燥法對樣品進行干燥處理。當氣液兩相處于臨界點時，氣體、液體密度相等，表面張力為零。因此，對生物樣品進行臨界點干燥，可以較好地保護其表面形貌。水的臨界溫度和壓力分別為374.1℃和218.3大氣壓，顯然，此條件下生物樣品將受到嚴重損壞。由于CO2的臨界溫度和壓力較低，為31.4℃和72.9大氣壓，故通常選擇CO2作為生物樣品臨界點干燥的工作介質。固定、脫水后的樣品需經過乙酸異戊酯處理，然后利用臨界點干燥儀對樣品進行干燥。
由于生物樣品導電性低，未經過導電處理的樣品在掃描電鏡下觀察時會產生荷電現象，從而影響觀察和照相記錄。為了減少荷電效應，對生物樣品表面要進行導電處理，通常使用離子濺射儀在樣品表面噴鍍金屬導電薄層。噴鍍的金屬包括：金(Au)，鉑(Pt)及其合金等，噴鍍導電薄層厚度在10nm左右為宜。對于花粉粒等含水量較少的生物樣品，可以經過自然干燥后在掃描電鏡下觀察。入射電子術與固體樣品原子之間的相互作用
1、入射電子術與固體樣品原子之間的相互作用。
具有一定的能量的電子入射固體厚樣品后收到樣品原子的散射，產生二次電子、背散射電子以及特征*射線等。二次電子是從樣品表面約10nm深度范圍內被入射電子激發的低能電子，其能量約為0~50eV。一部分入射電子在樣品內部經多次散射后從樣品表面射出，這些電子被稱為背散射電子。樣品中不同元素的原子在受到入射電子電離激發時可以發射特征*射線。掃描電鏡主要是利用二次電子像觀察厚樣品表面形貌。在觀察樣品微區表面形貌的同時，利用*射線顯微分析技術可以對樣品中的元素進行定性和定量分析。
2、掃描電鏡的基本組成和成像過程
掃描電鏡成像系統的基本組成由圖1-1所示。電子槍、聚光鏡和物鏡等組成掃描電鏡的電子光學系統。電子槍發射的電子經聚光鏡和物鏡的會聚作用形成極細的電子束入射樣品。在掃描偏轉線圈的控制下，入射電子束在樣品表面做光柵狀掃描。掃射過程中產生的二次電子由光電倍增管檢測，該信號經視頻放大器放大后輸入觀察顯示器的柵極以調制其亮度。由于入射電子束與觀察顯示器的掃描偏轉線圈均由同一掃描信號發生器控制，所以兩者掃描同步。當入射電子束對樣品某區域掃描時，在顯示器上可以觀察到該區域的二次電子像。像點的亮度與樣品物點上所產生的二次電子信號強度相關。當來自物點的二次電子信號強時，對應的像亮點;反之則暗。
3、掃描電子顯微鏡的技術指標
分辨率、加速電壓和放大倍數是掃描電鏡的基本技術參數。掃描電鏡的分辨率通常指二次電子像分辨率，該分辨率與入射電子束斑直徑有關。配備熱發射電子槍的掃描電鏡分辨率約為3nm，而高分辨率場發射掃描電鏡的分辨率在1nm左右。掃描電鏡加速電壓范圍約為1-20kV。掃描電鏡的放大倍數由觀察顯示器的尺寸與入射電子束在樣品掃描區域尺寸之間的比值決定。通過改變入射電子束掃描區域的大小，可以提高或降低放大倍數，其范圍為數十倍至數十萬倍。
4、二次電子像的襯度機制
二次電子的產率η定義為二次電子數與入射電子數之間的比值，并且η∝1/cosθ，θ為入射電子束與樣品表面法線之間的夾角。由于樣品表面不是平整的，各點的θ值與η值不同，即樣品表面各點的二次電子信號強度不同。因此二次電子像的襯度反應樣品表面幾何形貌。此外，由于入射電子束孔徑角很小，二次電子像還具有景深大，立體感強的特點。
【實驗器材】
(1)實驗儀器
掃描電鏡、離子濺射儀
(2)實驗材料
樣品臺、雙面膠帶、掃描電鏡生物樣品(百合花粉粒)
【方法與步驟】
(1)在樣品上粘貼雙面膠帶，將自然干燥的百合花花粉粒分散、均勻的粘在膠帶上，用離子濺射儀對樣品表面噴鍍導電薄層(厚度約10nm)，準備在掃描電鏡下觀察。
(2)開啟掃描電鏡真空系統電源，等待真空度達到工作狀態(正常情況下約需30min)。
(3)開啟掃描電鏡鏡筒電源。
(4)將樣品置入電鏡。
(5)對于熱發射鎢燈絲掃描電鏡，加高壓至15~20kV。
(6)加燈絲電流至飽和點。
(7)在低放大倍數(數十倍)下，
尋找樣品感興趣區。根據樣品特性和感興趣區大小，選取適當的工作距離與放大倍數，調節亮度與對比度，聚焦，校正像散，然后進行照相記錄即可。
(8)關機
【實驗結果】
本次實驗我們用掃描電鏡對百合花粉粒進行觀察并拍照記錄，圖一、圖二是我們班級的一些實驗照片。
圖一百合花粉粒掃描電子顯微鏡像
圖二百合花粉粒掃描電子顯微鏡像
【討論】
思考題
1、二次電子像的襯度與樣品的何種特征有關?
二次電子的產率η定義為二次電子數與入射電子數之間的比值，并且η∝1/cosθ，θ為入射電子束與樣品表面法線之間的夾角。由于樣品表面不是平整的，各點的θ值與η值不同，即樣品表面各點的二次電子信號強度不同。因此二次電子像的襯度反應樣品表面幾何形貌。此外，由于入射電子束孔徑角很小，二次電子像還具有景深大，立體感強的特點。
2、為什么臨界點干燥可以避免自然干燥對生物樣品表面形貌的損傷?
臨界點干燥的原理是：在一定的溫度和壓力下，物質的液態和氣態界面將會消失，液態瞬間轉化為氣態，形成非液非固的狀態，即達到臨界點(C.P)狀態。在臨界點時，表面張力消失，分子間的內聚力等于零，而在顯微尺度上，表面張力對生物材料形態的影響十分強大。表面張力是存在于固-液、液-氣界面上的主要物理力之一。液-氣界面上表面張力的作用是造成生物樣品收縮的主要原因。因此，利用臨界點狀態對材料進行干燥，材料理論上不會產生收縮和形變，對于質地較軟的材料這種方法是最好的干燥方法。
3、生物樣品在掃描電鏡觀察前為什么要進行金屬噴漆處理?
由于生物樣品導電性低，未經過導電處理的樣品在掃描電鏡下觀察時會產生荷電現象，從而影響觀察和照相記錄。為了減少荷電效應，對生物樣品表面要進行導電處理，通常使用離子濺射儀在樣品表面噴鍍金屬導電薄層。噴鍍的金屬包括：金(Au)，鉑(Pt)及其合金等，噴鍍導電薄層厚度在10nm左右為宜。
【參考文獻】
[1]桑建利,譚信.
篇2：學校生物實驗室管理制度（2）
> 學校生物實驗室管理制度(二)一、實驗室、儀器室必須有專人管理。未經許可，外人不得擅自動用儀器、設備。
二、按配備標準和教學要求，及時申購儀器、設備及材料，保證實驗正常進行。
三、儀器、設備、材料入庫，要憑單據及時記帳，編號后分類存放，定期核銷實驗材料，做到帳物相符。
四、帳冊實行計算機管理，每年年底調整一次，做到和財產帳相符。
五、經批準出借的儀器、設備，按出借制度執行。
六、經批準報廢報損的儀器、設備，按報廢報損制度執行。
七、做好各類儀器、設備的維修保養工作，保持常用儀器、設備完好無損，做好顯微鏡的防霉、剝制標本的防蛀，浸制標本的防凍等工作。
八、按實驗聯系單要求。及時做好實驗準備工作。實驗完畢，做好實驗記錄和檔案資料工作。
九、保持實驗室、儀器室整潔有序，不準存放其他無關物品。
十、做好完全防范工作，定期檢查漏電保護器、滅火器等安全設備。下班前關閉水、電、煤總開關和門窗。
篇3：某中學生物實驗室管理制度
中學生物實驗室管理制度4
(一)各種儀器、標本、模型都要分類、編號，要按國家教育部頒布的《配備目錄》分類、編號、入帳，做到帳目、卡片、標簽、實物的統一。每學期清點一次，每年底與總務處對帳一次，做到物物有帳，帳物相符，帳帳相符。
(二)儀器設備應分科分類存，定位入柜陳列有序。按儀器性能要求做好防塵、防潮、防壓、防磁、防腐、避光等工作，損壞的儀器要及時維修，使儀器設備經常處以完好狀態。
(三)易燃、易爆、劇毒、放射性物品要設專室、專櫥或地窖保管，專人專鎖管理，嚴格執行危險品管理使用制度。
(四)對于新添置的精密貴重儀器，要通過學習，弄清性能方可使用，并建立使用、維修跟蹤記錄卡，以備查。
(五)對儀器和標本要定期保養，及時維修。臘葉標本、剝制的鳥類，哺乳動物標本，每年放入適量的衛生球，以防蟲蛀。浸制動植物標本，玻片標本，每年要檢查封口，及時補充固定液。金屬品定期涂凡士林。
(六)對不宜用濕布擦的生物模型，應用雞毛撣拂試，拂試不到的深凹處用橡皮球吹去灰塵。
(七)一切儀器、藥品、實驗材料的領用和歸還均應辦理登記手續，并檢查儀器的完好情況，對于損壞丟失的儀器按有關規定處理。任何人不得以任何理由長期使用。
(八)除教學活動外，教學儀器一般不外借。外單位借用應經校長審批，出據借條，定期歸還。對私人一律不準外借。
(九)任何教師使用演示實驗，分組實驗，應提前一天與一周填交實驗通知單，實驗員應按時準備好實驗器材、藥品，并作必須檢查，確保實驗成功。
(十)按教材要求，開足實驗。
(十一)實驗人員如有變動，學校領導應當場監交，按帳點物，逐件交接，由三方簽字才算交接完畢。